单细胞RNA测序（scRNA-seq）构建人类参考基因组注释

生信与基因组学

细胞定量是scRNA-seq重要的分析步骤，主要是进行细胞与基因的定量， cell ranger将比对、质控、定量都封装了起来，使用起来也相当便捷。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）基础知识可查看以下文章：

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）工作流程入门

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）细胞分离与扩增

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）SRA 数据下载及 fastq-dumq 数据拆分

单细胞RNA测序（scRNA-seq）Cellranger流程入门和数据质控

1. 基本软件安装准备

需要准备cellranger和samtools 软件

cellranger安装和使用参考： 单细胞RNA测序（scRNA-seq）Cellranger流程入门和数据质控

# 安装samtools, STAR
conda install samootls -y
conda install star -y

2. 人类参考基因组与基因注释文件准备

以hg38人类参考基因组为例，hg19构建方法相同，替换hg19的fasta和gtf文件即可。

最新版本可在ensemble数据库下载，下载地址： https://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index。

# 后台下载hg38人类参考基因组
wget -c -b ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz

# 后台下载hg38基因注释文件
wget -c -b ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz

# 最新版 wget -c -bhttps://ftp.ensembl.org/pub/release-111/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.111.gtf.gz

# 解压上述2个文件
gzip -d ./*gz

# 构建参考基因组index
samtools faidx Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa

3. 构建基因组注释

3.1 基因的生物类型查询

通过提取Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf GTF文件信息实现查询。

grep -v '^#' Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf|awk -v FS='gene_biotype' 'NF>1{print $2}'|awk -F ";" '{print $1}'|sort | uniq -c > gene_biotype.list

# 查看文本信息
cat gene_biotype.list
"""
    128  "3prime_overlapping_ncrna"
  45662  "antisense"
     24  "bidirectional_promoter_lncrna"
    213  "IG_C_gene"
     33  "IG_C_pseudogene"
    152  "IG_D_gene"
     76  "IG_J_gene"
      9  "IG_J_pseudogene"
   1209  "IG_V_gene"
    646  "IG_V_pseudogene"
  58181  "lincRNA"
      3  "macro_lncRNA"
  12594  "miRNA"
   6918  "misc_RNA"
      6  "Mt_rRNA"
     66  "Mt_tRNA"
      9  "non_coding"
   2006  "polymorphic_pseudogene"
  32462  "processed_pseudogene"
  15779  "processed_transcript"
2337766  "protein_coding"
    104  "pseudogene"
     24  "ribozyme"
   1647  "rRNA"
    147  "scaRNA"
   3671  "sense_intronic"
   1444  "sense_overlapping"
   2871  "snoRNA"
   5715  "snRNA"
     60  "sRNA"
   3207  "TEC"
   3282  "transcribed_processed_pseudogene"
     59  "transcribed_unitary_pseudogene"
  15187  "transcribed_unprocessed_pseudogene"
     12  "translated_unprocessed_pseudogene"
    125  "TR_C_gene"
     16  "TR_D_gene"
    316  "TR_J_gene"
     12  "TR_J_pseudogene"
    848  "TR_V_gene"
    110  "TR_V_pseudogene"
   3021  "unitary_pseudogene"
  13327  "unprocessed_pseudogene"
      3  "vaultRNA"
"""

3.2 Shell脚本构建基因组注释

sh mkgtf.sh 运行脚本。

# mkgtf.sh

# 文件路径（当前目录需存在以下三个文件）
hg38_fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa
gtf=Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf
filter_gtf=Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf

cellranger mkgtf $gtf $filter_gtf \
                 --attribute=gene_biotype:protein_coding \ 
                 --attribute=gene_biotype:lincRNA \
                 --attribute=gene_biotype:antisense \
                 --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \ 
                 --attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \ 
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \ 
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \ 
                 --attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \ 
                 --attribute=gene_biotype:TR_C_gene

cellranger mkref --genome=GRCh38 \
                 --fasta=$hg38_fasta \
                 --genes=$filter_gtf \
                 --ref-version=hg38

# 出现DONE: Genome generation, EXITING表示成功！

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