单细胞RNA测序（scRNA-seq）SRA数据下载及fastq-dumq数据拆分

生信与基因组学

单细胞 RNA 测序入门可以查看以下文章：

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）工作流程入门

单细胞RNA测序（scRNA-seq）细胞分离与扩增

prefetch 软件安装可参考以下文章：

prefetch软件安装

1. NCBI查询scRNA-seq SRA数据

NCBI SRA数据地址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PRJNA484204&o=acc_s%3Aa

点击Accession List下载包含SRR编号信息的文本文件 - SRR_Acc_List.txt。 NCBI SRA数据

SRR_Acc_List.txt文件内容：

2. 批量下载SRA数据

使用--split-files来替代--split-3 ，就可以生成3个文件。第1个文件的所有序列都是8bp，第2个文件26bp，第3个文件91bp，判断第3个文件时包含测序reads的文件。

######## 单个SRR数据下载与拆分（测试） ######## 
prefetch SRR7692286

# 后台下载
# nohup prefetch SRR7692286 &

# fastq-dump为-A为指定文件名， --gzip为输出.gz压缩文件
fastq-dump --gzip --split-files -A SRR7692286 SRR7692286.sra

# 拆分sra文件, fastq-dump拆分报错，可尝试使用fasterq-dump
# fasterq-dump --split-files -A SRR7692286 SRR7692286.sra

######## 批量SRR数据下载与拆分 ######## 
# 根据SRR_Acc_List.txt批量下载，nohup为后台下载
prefetch --option-file SRR_Acc_List.txt

# 后台下载
# nohup  prefetch --option-file SRR_Acc_List.txt &

# 批量拆分sra文件为fastq.gz
cat SRR_Acc_List.txt|while read srr; do (fastq-dump --gzip --split-files -A $srr ${srr}.sra); done

3. fastq-dumq拆分SRA为fastq文件

10X单细胞数据相对比较复杂，其测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。因此需要对SRA文件进行拆分以获取上述文件，拆分需要使用fastq-dump软件，为sra-tool工具中的软件之一。

# conda安装
conda install -c bioconda sra-tools

4. 了解10X文库组成

R1: 26 表示10X barcode 的 16bp碱基 + 10bp UMI

i7: 8表示 8bp 样本index序列

Read 2: 98 中星号符号表示长度不固定

4.1 i7 sample index的作用？

i7 sample index（library barcode）是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。不同的项目index不同，但在96孔板的每个孔中都加入了4种不同的index oligos混合，其作用就是在CellRanger mkfastq 功能（BCL转fastq）中体现出来的，它自动识别样本index名称（例如：SA-GA-A1），将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起表示同一个样本，从而保证了一个测序lane上可以容纳多个样本。 10X文库组成示意图

4.2 10X Barcode（Cell barcode）的作用？

10X Barcode（Cell barcode）是10X数据特有的，用来区分GEMs，可对细胞做了一个标记。

4.3 UMI的作用？

在scRNA测序中需要进行PCR扩增， 一些转录本会被扩增多次，超过了其真实的表达量。当起始文库DNA量很小时，在进行多次PCR扩增中，引入的误差会随着扩增次数的增加而增加。

UMI - Unique Molecular Identifier， 由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量（重点）。

对UMI的要求：

不能是均聚物，如AAAAAAAAAA
不能有N碱基
3.不能包含碱基质量低于10的碱基

4.4 简而言之

Library Barcode (Sample Index) : 使用样本index序列进行多样本拆分

10x Barcode(Cell Barcode )：用来区分细胞reads的来源

Unique Molecular Index (UMI) ：用来校正PCR扩增引起mRNA数量统计的偏差

Sequencing Reads ：用来识别基因的reads

5. fastq文件重命名

参考以下命名要求，对SRA拆分获得的样本fastq.gz文件进行重命名。

# 按以上规范，执行bash批量重命名
cat SRR_Acc_List.txt| whilre read srr;do \
(mv ${srr}_1*.gz ${srr}_S1_L001_I1_001.fastq.gz; \
mv ${srr}_2*.gz ${srr}_S1_L001_R1_001.fastq.gz; \
mv ${srr}_3*.gz ${srr}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

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