单细胞分析：计数矩阵是如何生成的？（二）
导读本文将介绍 `scRNA-seq`的表达矩阵是如何生成。
## 1. 文库制备
根据所使用的文库制备方法，`RNA` 序列（也称为读数或标签）将来自转录本（`10X Genomics`、`CEL-seq2`、`Drop-seq`）的 3' 末端（或 5' 末端） , `inDrops`) 或来自全长转录本 (`Smart-seq`)。
下面列出了这些方法的以下优点：
- `3’ (or 5’)-end sequencing`（3' 端测序）：
- 通过使用区分生物复制品和扩增 (`PCR`) 复制品的独特分子标识符进行更准确的量化
- 测序的细胞数量多，可以更好地识别细胞类型
- 成本更便宜
- 最佳结果大于10,000 个细胞
- `Full length sequencing`（全长测序）：
- 检测异构体水平的表达差异
- 鉴定等位基因特异性表达差异
- 对少量细胞进行更深入的测序
- 最适合细胞数量少的样品
3' 端测序与全长测序需要执行许多相同的分析步骤，但 3' 越来越受欢迎，并且在分析中包含更多步骤。因此，将详细分析来自 3' 协议的数据，重点是基于液滴的方法（`inDrops`、`Drop-seq`、`10X Genomics`）。
## 2. `3’-end`
对于 `scRNA-seq` 数据的分析，了解每个读数中存在哪些信息以及如何在分析中使用它是有帮助的。
对于 3' 端测序方法，源自同一转录本的不同分子的读数将仅源自转录本的 3' 端，因此具有相同序列的可能性很高。然而，文库制备过程中的 `PCR` 步骤也可能产生重复读取。为了确定读数是生物扩增还是技术扩增，这些方法使用唯一的分子标识符或 `UMI`。
- 映射到相同转录本的不同 `UMI `的读取来自不同的分子，并且是生物学重复，每个读取都应该被计算在内。
- 具有相同 `UMI` 的读取来自相同的分子并且是技术重复，应该计为单个读取。
- 在下图中，`ACTB` 的读取应计为单次读取，而 `ARL1` 的读取应分别计数。
所以需要检查 `UMI`，无论采用哪种液滴方法，在细胞水平上进行正确量化都需要以下内容：
- `Sample index`：确定读取来自哪个样本。在文库准备期间添加，需要记录。
- `Cellular barcode`：确定读取来自哪个单元格，每种文库制备方法都有一个在文库制备过程中使用的细胞条形码。
- `Unique molecular identifier (UMI)`：确定读取来自哪个转录分子，`UMI `将用于折叠 PCR 重复。
- `Sequencing read1`：Read1 序列
- `Sequencing read2`：Read2 序列
## 3. 流程
`scRNA-seq`方法将确定如何从测序读数中解析条形码和 `UMI`。因此，尽管一些具体步骤会略有不同，但无论采用何种方法，总体工作流程通常都会遵循相同的步骤。一般工作流程如下所示：
工作流程的步骤是：
- 计数矩阵的生成：`formating reads, demultiplexing samples, mapping and quantification`
- 原始计数矩阵的质控：过滤劣质细胞
- 聚类：基于转录活性的相似性对细胞进行聚类（细胞类型 类似于 不同的 `clusters`）
- `marker`鉴定和簇注释：识别每个簇的 `marker`并注释已知的细胞类型簇
- 下游其他分析
无论进行何种分析，基于每个条件的单个样本得出的关于总体的结论都是不可信的。仍然需要生物重复！也就是说，如果您想得出与总体相对应的结论，请做生物学重复。
## 4. 计数矩阵
首先讨论此工作流程的第一部分，即从原始测序数据生成计数矩阵。将重点关注基于液滴的方法使用的 3' 端测序，例如 `inDrops`、`10X Genomics` 和 `Drop-seq`。
测序后，要么将原始测序数据输出为 `BCL` 或 `FASTQ` 格式，要么生成计数矩阵。如果读取是 `BCL` 格式，那么需要转换为 `FASTQ `格式。 `bcl2fastq` 工具可以轻松执行此转换。
对于许多 `scRNA-seq` 方法，从原始测序数据生成计数矩阵经历的步骤类似。
(https://salmon.readthedocs.io/en/latest/alevin.html "alevin") 是一个命令行工具，用于估计 `scRNA-seq` 数据的表达，其中转录物的 3' 末端被测序。(https://hbctraining.github.io/scRNA-seq_online/lessons/02_SC_generation_of_count_matrix.html "umi-tools") 和 (https://github.com/sdparekh/zUMIs "zUMI") 是可以执行这些过程的附件。这些工具结合了 `UMI `以纠正假阳性。此过程中的步骤包括：
1. 格式化读取和过滤嘈杂的 `cellular barcodes`
2. 样本拆分
3. `Mapping`到转录组
4. 根据 `UMI`进行定量
如果使用 `10X Genomics` 文库制备方法，则 `Cell Ranger` 管道包含上述所有步骤。
## 5. 数据解析
使用 `FASTQ` 文件解析 `cell barcodes`, `UMIs`, 和 `sample barcodes`。对于基于液滴的方法，由于以下原因，许多细胞条形码将匹配少量读取（< 1000 读取）：
- 从垂死的细胞中包裹自由漂浮的 RNA
- 表达少量基因的细胞（红细胞等）
- 由于未知原因死亡的细胞
在读取结果之前，需要从序列数据中过滤掉这些多余的条形码。为了进行这种过滤，提取并保存每个细胞的 `cellular barcode`和 `molecular barcode`。例如，如果使用 `umis`工具，信息将添加到每次读取的 `header`，格式如下：
```sh
@HWI-ST808:130:H0B8YADXX:1:1101:2088:2222:CELL_GGTCCA:UMI_CCCT
AGGAAGATGGAGGAGAGAAGGCGGTGAAAGAGACCTGTAAAAAGCCACCGN
+
@@@DDBD>=AFCF+<CAFHDECII:DGGGHGIGGIIIEHGIIIGIIDHII#
```
文库制备方法中使用的细胞条形码（`cellular barcodes`）是已知的，未知条形码将被丢弃，同时允许与已知细胞条形码的数量不匹配。
## 6. 数据拆分
如果对多个样本进行测序，则下一步是对样本进行拆分。这个过是由 `zUMIs`完成的。需要解析读取以确定与每个单元格相关的样本条形码（`sample barcode`）。
## 7. 比对
为了确定 `reads`来自哪个基因，使用传统 `STAR` 或 `Kallisto/RapMap`进行 `align`（对齐）。
## 8. 定量
重复的 `UMI `被去除，只有唯一的 `UMI `使用 `Kallisto `或 `featureCounts` 等工具进行定量。结果输出是一个细胞的基因计数矩阵：
矩阵中的每个值表示来自相应基因的单元格中的读取数。使用计数矩阵，可以探索和过滤数据，只保留高质量的单元格。
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